核酸分子杂交的基本原理

从化学和生物学意义上理解，探针(Probe)是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特异靶分子反应。抗原-抗体、外源凝集素-碳水化合物、亲和素-生物素、受体-配体(ligand)以及互补核酸间的杂交均属于探针-靶分子反应。蛋白质探针（如抗体）与特异靶分子是通过混合力（疏水、离子和氢键）的作用在少数特异位点上的结合，而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同，通过氢键在几十、几百甚至上千位点上的结合。核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍有可能进行碱基配对，这取决于修饰的部位和修饰物的性质。标记的探针每1kb只掺入10-30个修饰碱基，仅4％-12％的单个碱基被修饰的类似物取代了。尽管掺入位点外的碱基配对较弱或不存在，但对整个杂交分子的稳定性影响很小。

核酸探针的种类

根据标记方法不同可分为：放射性探针；非放射性探针两大类，根据核酸的性质不同又可分为：DNA探针RNA探针cDNA探针cRNA探针DNA探针还有单链(ssDNA)和双链(dsDNA)之分。所以原位杂交可分为DNA-DNA，cDNA-RNA，RNA-RNA和寡核苷酸与DNA或RNA等杂交方式。

核酸标记方法及其显示方法（一）核酸探针的放射性标记技术1.缺口平移标记方法其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针的一条链上制造一个缺口（nick），缺口处形成3’-羟基末端，在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’-羟基本上。同时根据大肠杆菌DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口5’端核苷酸依次切除，其结果是在缺口的5’端不断消除核苷酸而在3’端则依次添加核苷酸，从而使缺口沿着互补DNA链移动，故称缺口平移（nicktranscription）。根据这个原理，用α-32PdATP置换先前存在的核苷酸，则可制备高活性的DNA探针，能满足大多数杂交的要求。

2.DNA快速核酸标记大肠杆菌聚合酶I经枯草杆菌酶切割可得到两条多肽链，其中分子量为76kD的大片断称为Klenow片段。该酶具有完整聚合酶I的5’→3’核酸聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，但缺乏5’→3’核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填补由限制性酶消解DNA所产生的3’凹陷末端。因此，用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3’末端。用Klenow片段标记末端一般只用一种[α-32P]dNTP，加入反应的[α-32P]dNTP取决于延伸的5’末端序列。

3.用T4T4多核苷酸激酶标记DNA5DNA5’’末端寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此方法。T4多核苷酸激酶(polynucleotidekinase,PNK)是由T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5’-OH末端。在过量ADP存在时，也可促进磷酸交换反应，使PNK将DNA末端5’磷酸转移到5ADP上生成ATP，然后催化[α-32P]dNTP上的标记磷酸转移至DNA的5’末端，从而使DNA重新磷酸化，并得到标记。注意要用碱性磷酸酶去掉磷酸基团。

4.随机引物延伸标记方法是从单链DNA或RNA模板合成高比活性的32P标记探针所选用的方法。原理是使长6-8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应时将α-32PdNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针DNA。因为所用真核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板DNA随机发生退火反应，因此，被称为随机引物(randomprimer)。这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。

5.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是一种分子生物学新技术，由于美国Cetus公司人类遗传学部的KaryB.Mulli于年创立。该技术利用两个与相反链杂交并随着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA片断，包括膜板变性、引物退火和引物延伸三个步骤的反复循环，最终两引物所夹靶DNA得到千万倍以上的扩增。可用来标记高比活性的DNA探针，PCR技术有很高的特异性，可以在1-2小时内大量合成探针DNA片断。如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它标记的dNTP，则探针DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物掺入率可高达70％-80％。PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。该法的特点是要合成一对特异性PCR引物。

6.体外转录法先把DNADNA片段克隆到有噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNARNA聚合酶的作用下，以DNADNA为模板，以含有标记的三磷酸核糖核苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，所谓启动子(promotorpromotor)，，又称启动基因，是入出境DNADNA分子上可与RNARNA聚合酶特异性结合而使转录开始的部位，而启动子本身并不被转录。体外转录常用的噬菌体转录启动子有沙门氏菌噬菌体SP6SP6和大肠杆菌噬菌体T3T3，，T7T7。当二个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧，而且互相呈相对方向时，则可分别启动插入DNADNA片段SenseSense和AntisenseAntisense的转录。转录前要用限制酶先在cDNAcDNA插入点的下游切割，使DNADNA直线化，做为模板，以标记的三磷酸核糖核苷为原料，转录合成RNARNA探针。

（二）核酸探针的非放射性标记技术1.光敏生物素标记核酸有二种光敏生物素：均由一个光敏基团、一个链接臂和一个生物素基团组成。光生物素：光敏基团是-N3，在光作用下可与核酸中的碱基结合。补骨脂素生物素：光敏基团是补骨脂素，在光照（-μm）下，可与单链或双链DNA发生反应，反应主要在T上，C上也有一定程度的反应。光敏生物素的连接臂含有6-12个碳原子，用以减少探针杂交时的空间位阻。此方法简单，灵敏度可达ng水平，可用于外源基因的检测

2.酶促生物标记核酸以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP,Bio-11-dCTP）等代替相应32P标记的脱氧核苷三磷酸，以DNA聚合酶作用掺入DNA。Bio-dUTP代替dTTP，Bio-dATP代替dATP，Bio-CTP代替dCTP。Bio-11-dUTP的11是指生物素基团与脱氧核苷酸之间连接臂的碳链长度。常用的酶促生物标记DNA的方法有缺口平移法和随机引物延伸法。

3.寡核苷酸的生物素末端标记5’-磷酸的化学标记法：将寡苷酸的5’-磷酸接上一个乙二胺，然后用琥珀亚胺生物素，将生物素基团连接到磷酸酰胺基上。3’-OH的酶捉标记法：用末端转移酶将Bio-11-dUTP加于其3’-OH端，脱去一个焦磷酸。4.酶标DNADNA标记试剂：辣根过氧化物酶（HRP）；碱性磷酸酶（AP）通过对苯醌（PBQ）与聚乙烯亚胺（PEI）连接而成（HRP-PBQ-PEI+），此试剂在戊二醛的作用下与变性的DNA结合，使HRP与DNA连接在一起，组成HRP标记的DNA探针。

5.酶标寡核苷酸核苷酸5’-末端标记HRPHRP法：在HRP中产生一个-SH反应基团，在寡苷酸合成终了加在5’-端，带一个C6的-HS，与活化的HRP反应生成5’-HRP寡苷酸。内中标记APAP法：

在合成寡核苷酸过程中将一个5’带连接臂及CF3基团的尿苷3’亚磷酰亚胺合成在寡核苷酸链中，合成后此活化的寡核苷酸与AP即得到AP标记的寡核苷酸。6.DNA其原理与Bio-11-dUTP相同，只是用毛地黄甙抗体检测标记在DNA上的半抗原分子地高辛（Digoxigenin，DIG）。

（三）非放射性探针的显示体系1.APAP显色体系ASO-AP+BCIP→BCI-OH+PiBCI-OH+NBT→紫色ASO：等位基因特异的寡核苷酸BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸NBT：四氮唑蓝Pi：磷酸2.HRPHRP显色体系HRP+H2O2→[HRP?H2O2]ODA-NH2+[HRP?H2O2]→ODA-N=ODA/棕色↓+HRP+H2OODA；邻-联茴香胺

3.ABC显色体系DNA-B+SA-AP→DNA-B-SA或DNA-B+SA+BAP→DNA-B-SA-BAPSA：streptavidin(链霉亲合素)BAP：生物素化的磷酸酶B：biotin(生物素),ABC:avidin-botin-enzyme







































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